Mitochondrial localization and involvement in cell death

In several neurodegenerative disorders, including Alzheimer disease (AD) and Parkinson disease (PD), protein aggregation is accompanied by mitochondrial dysfunction. An increasing number of proteins found in mitochondria have multiple localizations. The Amyloid β-peptide precursor protein (APP), a key protein in AD, has a chimeric targeting signal (endoplasmic reticulum (ER) + mitochondria). APP is subsequently cleaved by the βand γ-secretase resulting in production of the Amyloid β-peptide (Aβ) of different lengths (e.g. Aβ40 and Aβ42). The γ-secretase complex consists of, presenilin (PS)-1 or -2, Nicastrin (Nct), Aph-1 and Pen-2. Interestingly, both PS and Aβ have been found in mitochondria. The aim of this thesis is to investigate if all the γ-secretase components are present in mitochondria and furthermore, to study the mitochondrial uptake mechanisms for Aβ and to assess the stability and activity of the γ-secretase complex during cell death. In paper I we identified a chimeric targeting signal (ER+ mitochondria) in Nct and showed that active γ-secretase complexes are localized to mitochondria. In paper II Nicastrin was detected in mitochondria independently of PS, PS was detected in mitochondria independently of Nct, and Aph-1 was detected in mitochondria independently of PS or Nct. Further, Nct interacted with the mitochondrial import machinery and ~3% of all Nct and ~1.5% of the active γsecretase complexes were located to mitochondria. The topology of the mitochondrial γ-secretase complex was similar to the reported topology of the γ-secretase complex in ER. In paper III Aβ40 and Aβ42 were found to be imported through the TOMcomplex, translocase of the outer membrane, in the mitochondrial import machinery and found to be localized to the mitochondrial cristae. The same localization pattern was also detected in samples from human cortex with amyloid plaques. In paper IV the stability and activity of γ-secretase complexes during cell death were investigated. γ-Secretase was shown to be active and to contain a caspase cleaved C-terminal of PS1 (PS1-caspCTF). Transient transfections with a caspCTF construct reconstituted the γ-secretase activity in PS null cells (BD8) and apoptotic HEKAPPswe cells showed Aβ40 production. In paper V the Aβ40 and Aβ42 production by γ-secretase complexes containing PS1-caspCTF were investigated in cells stably expressing PS1-caspCTF or PS1-CTF on a PS null background (BD8 cells). Here we demonstrated a significant increase in the intracellular Aβ42/Aβ40 ratio in PS1-caspCTF cells as compared to PS1-wtCTF cells. We here present data linking some of the central proteins of AD pathogenesis to mitochondria and indicating an altered Aβ production during cell death. Mitochondrial dysfunction may underlie the loss of synapses occurring in AD. Therefore, future drugs targeting mitochondria to strengthen their function may be a novel strategy for treatment of AD. SAMMANFATTNING PÅ SVENSKA Proteiner är viktiga beståndsdelar i våra kroppar och verkar som biologiska katalysatorer och som byggstenar i våra celler. Varje cell behöver energi för att tillverka och bryta ner proteiner samt skicka signaler till celler i sin omgivning. Denna energi erhålles genom en process som kallas oxidativ fosforylering och som sker i mitokondrien, cellens kraftverk. I denna process bildas energimolekyler, ATP, som fungerar som uppladdningsbara batterier i kroppen som hela tiden måste fyllas på. Hjärnan står för ca en femtedel av hela kroppens glukosåtgång och nervcellerna behöver energi för att kunna kommunicera med varandra via kontaktpunkter som kallas synapser. Mitokondrierna producerar inte bara energi utan deltar dessutom i att bibehålla den normala kalciumnivån i cellen och deltar i celldödsmaskineriet. När mitokondrien släpper ut vissa proteiner kan de i sin tur aktivera celldödsmaskineriet genom att aktivera en kaskad där speciella protein, sk caspaser, klyver andra proteiner. Mitokondrier släpper inte bara ut proteiner utan tar även upp en mängd proteiner som den behöver för sina funktioner i cellen. Mitokondrien är omsluten av två membran som inte släpper igenom proteiner. Proteinupptaget behöver därför ske via ett specialiserat maskineri som består av två kanalsystem, translokaser av det yttre och inre mitokondriemembranet (TOM och TIM). Nervcellerna i hjärnan, neuron, behöver mycket energi och är därför sårbara för förändringar i mitokondrierna. I flera neurondegenerativa sjukdomar såsom, Alzheimers sjukdom (AD) och Parkinsons sjukdom (PD), har man kunnat koppla sjukliga förändringar i mitokondrier till sjukdomsförloppet. Cellen innehåller specialiserade avdelningar, organeller, och dessa innehåller olika proteiner med olika funktioner. Det finns även proteiner som förekommer i mer än en organell. För att proteinerna ska kunna verka normalt är det viktigt att de har rätt form och lokalisering i cellen. I både AD och PD har man kunnat se förändrade sjukdomsrelaterade proteiner som återfunnits i mitokondrierna. AD är den vanligaste orsaken till demens och är uppkallad efter Alois Alzheimer, en tysk läkare som på tidigt 1900-tal var först med att beskriva de förändringar i hjärnan som sker vid sjukdomen. Typiska kännetecken i hjärnan är inlagring av två olika proteiner, tau och amyloid-beta (Aβ) samt vävnadsdöd. Aβ produceras ständigt i våra celler och förekommer i två olika längder, en kortare form (Aβ40) som är den vanligaste och en längre mer ovanlig form (Aβ42) som lättare kan bilda olika aggregat. Aggregering av Aβ och tau stör cellens funktion, Aβ-aggregaten bildar till slut plack utanför nervcellerna medan tau aggregaten syns inuti nervcellerna. Försämring av korttidsminnet är ett av de tidigaste symptomen på AD. Så småningom får man även svårt att orientera sig i rummet och att komma ihåg ord, för att sedan få allt sämre minne och intellektuell förmåga. Ett tidigt sätt att undersöka en patient med misstänkt AD är att mäta glukosmetabolismen i hjärnan som är nedsatt hos AD-patienter. Den mest populära hypotesen som förklarar sjukdomsförloppet i AD är Aβhypotesen, vilken bygger på att sjukdomen beror av en ökad mängd Aβ samt mer av den längre formen, Aβ42 som lättare formar aggregat. Det är Aβ42 som bildar de stora aggregaten i hjärnan, sk plack, och som man tror är den giftiga formen av Aβ för nervcellerna. Aβ är en klyvningsprodukt från ett större protein, Amyloid Prekursor Proteinet (APP) och klyvs ut av två enzymer, βoch γ-sekretasen. γ-Sekretaset är ett enzymkomplex som består av fyra proteiner: Nicastrin, presenilin, Aph-1 och Pen-2. Jag har i mitt avhandlingsarbete studerat lokaliseringen av γ-sekretaset och Aβ proteinet till cellens kraftstationer, mitokondrierna. Dessutom har γ-sekretaset stabilitet och enzymaktivitet under celldöd undersökts. Studie 1 Bakgrunden till studie 1 är att presenilin lokaliserats till mitokondrien (Ankarcrona et al 2002). Presenilin utgör den aktiva delen av γ-sekretaset och har även visat sig vara viktigt för kalciumbalansen och celldödsmekanismer som är påverkade i AD. Vi gjorde en databassökning (iPSORT) för att leta efter mitokondriesignaler i γ-sekretas komponenternas proteinsekvens. Det enda proteinet som hade en mitokondriesignal var Nicastrin. Hela γ-sekretaskomplexet kunde påvisas i isolerade mitokondrier både som ett komplex och som de individuella proteinerna. Komplexets enzymaktivitet påvisades genom att mäta klyvningsprodukterna från APP. Studie 2 Efter att vi lokaliserat det aktiva γ-sekretaskomplexet till mitokondrier undersöktes var i mitokondrien som komplexet återfanns samt hur mycket av cellens aktiva γ-sekretas som var mitokondriellt. Våra data indikerar att ~1,5% av γ-sekretaskomplexet finns i mitokondrien och att det är lokaliserat till mitokondriens innermembran. Det finns däremot ~3% Nicastrin i mitokondrien och detta interagerar med mitokondriens importmaskineri. Vidare kunde nicastrin och Aph-1 tas upp av mitokondrien oberoende av presenilin. Dessutom kunde Aph-1 och presenilin tas upp av mitokondrien oberoende av Nicastrin. Studie 3 Bakgrunden till denna studie är att Aβ har visats orsaka mitokondriestress och en ökad produktion av fria radikaler. Dessutom har APP, det aktiva γ-sekretaskomplexet samt Aβ lokaliserats till mitokondrier. Då APP visats bli ofullständigt upptaget i mitokondrier, med Aβ-regionen utanför, så är det dock uteslutet att Aβ kan genereras inuti mitokondrier. Istället måste proteinet tas upp utifrån. Vi studerade detta upptag genom att inkubera mitokondrier med Aβ i närvaro av olika inhibitorer för att se om och hur mitokondrierna tog upp Aβ. Här visade vi att Aβ togs upp via TOMmaskineriet, mitokondriens importmaskineri och att Aβ främst ackumulerades i mitokondriens innermembran. Studie 4 I AD-hjärnan postmortem har man funnit spår av pågående celldöd, såsom aktiva caspaser. Caspaser har visat sig kunna klyva presenilin, som utgör den aktiva delen i γsekretaskomplexet, och APP, samt kunna leda till en ökad Aβ-produktion. Här studerade vi γ-sekretaskomplexets stabilitet samt aktivitet i en neuroblastomcellinje som genomgår celldöd. Vi fann att komplexet var aktivt samt att det kunde innehålla caspaseklyvt presenilin och att detta caspaseklyvda γ-sekretaskomplex var aktivt. Studie 5 För att studera om caspaseklyvt γ-sekretaskomplex påverkar Aβ42/Aβ40-produktionen framställde vi celler som endast uttryckte det caspaseklyvda respektive oklyvda γsekretaskomplex och mätte Aβ42/Aβ40-produktionen. Här visade det sig att det caspasklyvda γ-sekretaskomplex hade en ökad Aβ42/Aβ40-produktion i förhållande till oklyvt komplex. Sammanfattningsvis skulle dessa studier kunna ge ledtrådar till de olika processer som kan orsaka eller bidra till sjukdomsförloppet i AD. PS och γ-sekretaskomplex är involverade i cellens kalciumbalans samt celldöd. De kan dessutom påverka mitokondriens funktion så att dess kapacitet att lagra kalcium försämras. Detta kan bidra till att sätta igång frisläppning av mitokondrieproteiner som sedan startar cellens dödsmaskineri. Mitokondriens upptagsmekanism och lokalisering av Aβ kan förklara hur Aβ orsakar mitokondriestress. I AD-hjärnan försvinner först signaleringsenheterna, synapserna, och det har visats att caspaser är aktiva i synapser hos AD-patienter vilket skulle kunna indikera att det finns caspasklyvt γ-sekretaskomplex i synapsen. Detta i sin tur skulle leda till en ökad Aβ42-produktion samt Aβ42-aggregering som är ett av de typiska kännetecknen för AD. Dessa studier kan öka förståelsen för de patologiska förändringar man sett i glukosmetabolism samt signalering i synapser hos AD-patienter och förhoppningsvis i framtiden bidra till att finna nya angreppspunkter för utveckling av läkemedel. LIST OF PUBLICATIONS I. Hansson CA, Frykman S, Farmery MR, Tjernberg LO, Nilsberth C, Pursglove SE, Ito A, Winblad B, Cowburn RF, Thyberg J, Ankarcrona M. Nicastrin, presenilin, APH-1, and PEN-2 form active γ-secretase complexes in mitochondria J. Biol Chem (2004) 279: 51654-51660 II. Hansson Petersen CA, Wiehager B, Li T, Wong P, Ankarcrona M. Nicastrin is located to mitochondria independently of presenilin Manuscript III. *Hansson Petersen CA, *Alikhani N, Behbahani H, Wiehager B, Pavlov PF, Alafuzoff I, Leinonen V, Ito A, Winblad B, Glaser E, Ankarcrona M. The amyloid beta-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae Proc Natl Acad Sci, USA (2008) 105: 13145-13150 IV. Hansson CA, Popescu BO, Laudon H, Cedazo-Minguez A, Popescu LM, Winblad B, Ankarcrona M. Caspase cleaved presenilin-1 is part of active gamma-secretase complexes J. Neurochem (2006) 97: 356-64 V. Hedskog L, Hansson Petersen CA, Svensson A, Welander H, Bogdanovic N, Tjernberg LO, Karlström H, Ankarcrona M. Caspase cleaved presenilin-1 in γ-secretase complexes increases the intracellular Aβ42/Aβ40 ratio Manuscript * These authors contributed equally